论文｜健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学调查
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作者：饶继红1,2，何彪2，涂长春2，张家宁1,2，葛淑敏1*，龚文杰2*
单位：1.长春理工大学生命科学技术学院；2.军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
简介：饶继红，硕士研究生，研究方向：动物病毒学。*通信作者：葛淑敏，副教授，博士，硕士生导师，从事生物检测、单克隆抗体制备及特异性菌种筛选等研发工作；龚文杰，副研究员，博士，硕士生导师，从事动物病毒学的预防控制研究。
基金项目：“十三五”国家重点研发计划项目（2017yfd0500104）。
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听作者讲述论文写作背景，和同行交流心得体会。
猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）引起的猪繁殖与呼吸综合征（prrs），是严重危害养猪业的重大传染疾病，也是世界动物卫生组织（oie）必须上报的动物疫病之一。prrsv基因组大小约为15kb，由9个重叠的开放阅读框组成。prrsv是具有囊膜的单股正链rna病毒，包括8个开放阅读框（orfs），其中orf1编码的蛋白与rna 复制和转录相关，非结构蛋白nsp2基因位于orf1区，orf5编码重要的保护性抗原糖蛋白gp5。nsp2和orf5在prrsv基因组中变异最大，是科学工作者研究prrsv分子流行病学及其遗传衍化规律常用的基因片段。
prrsv是危害世界养猪业的重要病原体之一。2006年，在我国高致病性prrsv的暴发直接导致了200多万头猪死亡。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（hp-prrsv）具有高致病性和传染性等特点，一旦传播就会给我国乃至全世界的养猪业造成巨大的经济损失。自2013年以来，由新的prrsv变异株nadc30-like引起prrv在我国的再次流行。
断奶仔猪处于一个较敏感的阶段，断奶效应、中断母体抗体供应以及外在环境因素的改变都会影响断奶仔猪的免疫机能，而仔猪的免疫系统一般4～8周才比较完善。虽然我国大部分规模化猪场都会对断奶仔猪进行prrsv疫苗免疫，但健康断奶仔猪是否存在prrsv持续性感染现象仍是值得关注的问题。
目 的
为进一步了解我国规模化猪场健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）的情况，笔者对2017年采集的国内规模化猪场健康断奶仔猪样品进行prrsv检测和遗传进化分析，旨在为有效防控prrsv提供数据支持，促进养猪业的健康发展。
方 法
对2017年采自我国25个省（市）38个规模化猪场的断奶仔猪咽拭子、肛拭子、血清共4059份样品进行了高通量测序，然后对检测到的病毒进行rt-pcr或pcr验证。
结 果
◆宏基因组学结果
将采集来自我国25个省（市）38个规模化猪场的咽拭子、肛拭子和血清进行高通量测序后，结果发现健康断奶仔猪携带有动脉炎病毒科等病毒，其中38个svm宏基因组中有16个svm宏基因组表现出现动脉炎病毒科病毒病毒基因片段，共1706条reads（表1）。
◆健康断奶仔猪携带prrsv的rt-pcr检测结果
为了进一步验证健康断奶仔猪携带动脉炎病毒科中prrsv的情况，利用rt-pcr对2017年4—5月采集自25个省（市）38个猪场的4059份健康断奶仔猪样品进行了检测，其中肛拭子、咽拭子、血清各1353份。共检测到46份prrsv阳性样品（阳性率为1.1%）（图1），包括咽拭子36份和肛拭子10份。
注：m.dl2000 dna marker；1.阳性对照；2.henhbg16（河南省肛拭子样品）；3.gxhxg16（广西省咽拭子样品）；4.gxhxy1（广西省咽拭子样品）；5.gxhxy4（广西省咽拭子样品）；6.gxhxy8（广西省咽拭子样品）；7.gxhxy9（广西省咽拭子样品）；8.gxhxy10（广西省咽拭子样品）；9.gxhxy11（广西省咽拭子样品）；10.阴性对照
图1 prrsv扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
在检测的38个猪场中，15个猪场检测出prrsv，猪场阳性率为39.5%，具体检测情况见表2。将pcr产物测序获得的序列进行blast比对，结果发现检测的阳性样品与高致病性prrsv的核苷酸同源性为96%～100%。
◆健康断奶仔猪prrsv的基因分型
利用rt-pcr从46份prrsv阳性样品中成功扩增出7个orf5基因（图2），分别为scmyy19（四川省绵阳市某规模化猪场咽拭子19号样品）、henhbg16（河南省鹤壁市某规模化猪场肛拭子16号样品）、gxhxy1、gxhxy4、gxhxy8、gxhxy11、gxhxy13（广西省南宁市横县某规模化猪场咽拭子1号、4号、8号、11号和13号），并对pcr产物进行了序列测定，基因大小为750bp。
注：m.dl2000 dna marker；1.scmyy19（四川省咽拭子样品）；2.henhbg16（河南省肛拭子样品）；3.gxhxy1（广西咽拭子样品）；4.gxhxy4（广西咽拭子样品）；5.gxhxy8（广西咽拭子样品）；6.gxhxy9（广西咽拭子样品）；7.gxhxy10（广西咽拭子样品）；8.gxhxy11（广西咽拭子样品）；9.gxhxy13（广西咽拭子样品）；10.gxhxg16（广西肛拭子样品）；11.阴性对照；12.阳性对照
图2 prrsv orf5基因的rt-pcr扩增结果
基于orf5基因核苷酸序列的系统发育树分析表明，所有的prrsv病毒株可以分为2种基因型：基因1型（欧洲型，type i）和基因2型（美洲型，type ⅱ）。type ⅱ 可以进一步划分为4个主要的亚群：亚群1是以vr-2332为代表的美洲型毒株；亚群2是nadc30-like重组毒株；亚群3是以ch-1a为代表的中国经典型毒株；亚群4是中国高致病性prrsv毒株。该试验中的7个prrsv 毒株都属于基因2型（美洲型，type ⅱ）中的亚群4（subgroup 4），与以lv 为代表的prrsv基因1型（欧洲型）病毒株遗传关系较远（图3）。
图3 基于prrsv orf5基因核苷酸序列的系统发育树
◆健康断奶仔猪prrsv的同源性分析
经序列比对发现，该研究获得的prrsv毒株间的orf5基因序列同源性为96.7%~100%，这些毒株与hp-prrsv代表株jxa1的核苷酸序列同源性最高，为97.7%~99.6%，与vr-2332株和lv株的orf5核苷酸序列同源性分别为89.2%~89.5%和63.6%~64.1%，与ch-1a株、ch-1r株和nadc30株的orf5核苷酸序列同源性分别为94.1%~95.0%、93.2%~94.1%和85.6%~86.5%。这些结果表明健康断奶仔猪携带的prrsv病毒株属于hp-prrsv。
结 论
基于高通量测序的宏基因组学结果显示，健康断奶仔猪的咽拭子、肛拭子、血清中共出现1706条动脉炎病毒科的病毒基因reads，其中包括prrsv。
通过rt-pcr扩增从咽拭子和肛拭子中共检测出46个prrsv样品，样品阳性率为1.1%，猪场阳性率为39.5%。基于orf5基因核苷酸序列的系统进化分析发现，该试验获得的prrsv流行毒株为高致病性毒株，属于type ⅱ中的subgroup 4。
该试验首次研究了全国规模化健康断奶仔猪携带prrsv的现状，研究结果可为猪繁殖与呼吸综合征防控提供重要的科学理论依据。
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采编：小白 排版：小同
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